当我们在思考时，大脑里的信息是如何传递和整合的？阿尔兹海默症患者为什么会失忆？抑郁症患者经历着怎样的神经系统紊乱？……一台重量只有2.17克的微型化三光子显微镜，或许可以让我们直观窥探大脑的一些奥秘。今年2月，中国科学院院士、北京大学未来技术学院教授程和平团队发布了一项“脑科学”领域的重大研究成果：该团队使用最新研发的微型化三光子显微镜，直接透过大脑皮层和胼胝体，首次对自由行为中小鼠的大脑全皮层和海马神经元功能实现了“深脑成像”，为揭示大脑深部结构中的神经机制开启了新的研究范式。
程和平（左）与赵春竹
在2023中关村论坛发布的“20项重大科技成果”中，“深脑成像”微型化三光子显微镜榜上有名，成为面向人民生命健康板块中的重大科技成果之一。“我想创造出一种显微镜，能够在生物自由行为下，看见神经元一闪一闪的动态变化，这是藏在我心底的一个梦想。”为了这个美丽的愿望，程和平及团队成员们十年如一日，不断拓展着人类对脑宇宙的认知疆域。
微型化三光子显微镜拍摄的小鼠大脑成像图
在北京大学膜生物学国家重点实验室设备研发平台内，记者看到了这台微型化三光子显微镜。与其说“看”，不如叫“观察”，因为这台显微镜只有成人的一个小拇指指头大小，放在手心掂量还不如一枚硬币沉，只有凑近仔细瞧，才能看清楚其微小体积背后的结构。“为了能够清晰地看到自由行为小鼠大脑深层的神经元功能信号，我们需要研发一种特殊的显微镜，它就像一个高分辨率的‘X光机’，可以穿透整个大脑皮层，看到神经元间的信号传导。”北大未来技术学院助理研究员赵春竹2018年加入程和平的团队做研究，第一个负责的课题就是“微型化三光子显微镜”，当年这一研究领域还仿若一片深不见底的“暗夜”，能做到什么程度，谁也说不清楚。想要了解这台微型化三光子显微镜的奥秘，就要搞清楚其背后的成像原理，赵春竹将它的专业名称拆分成三组，逐一向记者解释：“‘显微镜’好理解，通过光学成像把微小的物体放大到我们肉眼可见的大小。”“三光子显微镜”则能基于荧光分子同时吸收三个光子并发射荧光的效应，实现微米尺度的高分辨率光学成像。赵春竹指着一张散发着绿色荧光的深脑成像图解释，“相比于单光子和双光子，三光子激发波长更长，我们通过三光子成像可以清晰地看到全脑皮层和皮层下深部核团神经元的动态活动，从而了解大脑深处的奥秘。”“微型化”就是希望把显微镜做到拇指大小，让小鼠戴着跑，进而观察小鼠在觅食、社交、睡觉等自主行为时大脑神经元的真实活动和功能连接。赵春竹回忆，此前一个台式三光子显微镜足足能占大半个实验台，而为其“瘦身”并非易事。由于脑组织的高散射特性，深层脑区返回的荧光信号早已杂乱无章，只有通过大数值孔径物镜进行收集，才能保证接收到足够的信号。因此，他们选择保留物镜的高数值孔径这一核心参数，同时尽量为系统“瘦身”。2020年4月，团队研制的微型化三光子显微镜组装完成，重量6.5克，微型物镜数值孔径为1.0，直径8毫米，虽然测试成像深度接近1毫米，但是深层信号很弱。同期，德国一个该领域顶尖课题组研发出了重量仅5克的大鼠微型化三光子显微镜，这一成果发布也宣告着，团队花费两年的努力和成果被阶段性反超了。“想做一款足够轻、性能又足够好的微型化三光子显微镜，需要解决一个看似矛盾的问题：在减小物镜的数值孔径情况下，保持甚至增加荧光信号收集效率。”赵春竹反思。在之后的几个月里，他时刻在思考着这个问题。“物镜要足够短来增加散射荧光通过率，另外需要一种聚光能力更强的聚光镜。”一种全新的微型化三光子显微镜光学构型逐渐显露在赵春竹脑海中。而这一创新构想，也突破了数值孔径越高，荧光信号收集效率越高的常识，“直觉告诉我，就是它！”赵春竹激动地说。他第一时间向程和平汇报了新构型的仿真结果，得到了认可和支持，这也是实验室研发第二个微型化三光子显微镜的开端。只用短短几句话就概括出的这段故事，背后的艰辛只有经历过的人才懂。赵春竹的办公室里，有一张折叠式行军床，研发过程中，他有时会熬到深夜，来不及回家就在这张一米宽的行军床上凑合着眯一觉。而在他的办公桌上，一个精致的木质相框格外显眼，里面装着一张他亲手拍摄的照片：夕阳西下，站在北大校门对面的马路上回望校园，一道金光穿过云层，照射在北大教学楼上，“很明亮，很耀眼。”赵春竹说，这张照片就是那段时间拍摄的，他想用那个瞬间提醒自己，只要心中有光，就能照亮前行的方向，不论多么艰难。这道阳光，正像是暗夜中一束光，给微型化三光子显微镜的研发带来了新的希望和力量。这份力量，还来源于与赵春竹并肩作战的战友。有“大家长”程和平负责战略布局、指导决策，有北大电子学院副教授王爱民深厚的非线性光学基础以及飞秒激光器和空心光纤技术基础，有博士后吴润龙在电学系统上的经验，也有博士生陈诗源在实验室勤奋地搭建光路、测试成像等实战。
王爱民
为攻克微型化三光子显微镜的另一个瓶颈——零色散传输1300纳米飞秒激光的柔性空心光纤，王爱民带领团队研制出了空芯光子带隙光纤和空心反谐振光纤，让激光通过光纤传输到微型化探头的过程中，脉冲展宽很小、能量损耗很低，进而使三光子有效激发荧光分子。“不只是光纤。”赵春竹掰着手指头数，自研微型物镜、微型扫描镜、自研控制器、荧光采集系统等，“我们能在显微镜上看到的几乎所有装备零件，都是团队成员一个个参与研发、采购、安装的，为的就是突破‘卡脖子’难题，打造一台真正出自中国科学家之手的微型化三光子显微镜。”
从突破理论研究瓶颈，到产出研究成果，中间还有一段漫长的验证之路要走。在北大分子医学南京转化研究院，程和平带领团队搭建起了一个高端脑成像的公共技术服务平台“脑观象台”。在这里，微型化双光子显微镜、超灵敏结构光超分辨显微镜及高速三维扫描荧光成像系统等高端脑成像设备纷纷落地。凭借“脑观象台”的成像技术支持，科研团队也一次次收获惊喜，成果迭出：小鼠有喜新厌旧的行为，而孤独症小鼠却存在这一行为缺陷；小鼠在癫痫发作时，神经元会异常放电；小鼠的精神活跃程度与睡眠有关，在一天中定时开灯关灯，会影响其大脑的功能运作……南京转化院技术团队还开展了小鼠饲养、手术、行为范式及神经活动数据分析等工作，为神经科学家服务，也为远在千里之外的北京核心研发团队作实验支撑。2021年初，重量仅有2.17克、直径仅有3.4毫米的新版微型化三光子显微镜诞生，它可以佩戴在小鼠头上，同时不影响小鼠的自由活动。在活体成像实验中，当小鼠佩戴上显微镜探头后，一旁的屏幕上呈现出了小鼠大脑神经元活动的影像——从小鼠大脑皮层表面向下看到了第一至第六全皮层，穿过致密的胼胝体，最终看到了海马体的神经元在闪烁。“当时我们都不敢相信这是海马体，后来经过反复验证，才最终确认。”回忆起看到小鼠大脑神经元活动的场景，赵春竹仍抑制不住激动：“图像中一闪一闪的光亮，很漂亮，仿佛看到了生命的跃动。”为研究大脑对行为的支配，由南京转化院研究员张立风带领博士生张栋等组成的技术团队还对小鼠开展了抓取单粒糖豆的行为训练。为小鼠佩戴上微型化三光子显微镜，团队发现在小鼠顶叶皮层第六层神经元中，有一类神经元在抓取动作之前就开始活跃且在抓取时最活跃，另一类神经元在抓取动作之后才开始活跃。“这说明不同神经元参与了不同阶段的编码，也初步展示了微型化三光子显微镜在脑科学研究中的应用潜力。”赵春竹解释。随着行为学实验密集展开，2021年底，团队的研发到了关键时刻——“正当我们做最后一轮实验时，一个消息打乱了我们的计划，”赵春竹顿了顿，说，“我们获悉，德国的课题组又向国际权威科学期刊《自然-方法》杂志投了一篇论文，同样是研究微型化三光子显微镜。”就如同在接力的跑道上，突然发现对手已经跑到了前面，那种紧迫感，令研发团队的注意力高度集中。由程和平统筹团队制订计划，各成员明确分工，全力以赴地整理数据、撰写论文。“团队里几位老师都有其他的课题在做，但在那段时间，大家全部心无旁骛，除了吃饭睡觉，把所有精力都放在撰写论文上。”最终，仅用短短两周时间，就把所有数据和论文整理完毕，赶在2022年农历大年初一的晚上，把论文提交给了《自然-方法》杂志。然而，2022年5月，团队却收到了拒稿通知。之后又是第二轮、第三轮的论文修改，反复和杂志编辑在线上沟通。回忆起这段争分夺秒的经历，赵春竹直言，有紧张，有后怕，但更多的是感谢。“竞争不一定是坏事，感谢来自德国的‘假想敌’，更感谢一起并肩作战的战友们。”赵春竹回忆，“最后一轮修改完准备提交前，我仔细检查了论文中的每一句话，四年半来的经历就像在脑海里过电影一样，一段段看似冰冷的文字背后，一个个镜头、一幕幕场景都历历在目。”最终的结果，正如我们所见——2023年2月23日，微型化三光子显微镜的研究成果在国际权威科学期刊《自然-方法》杂志上成功发表，突破了此前微型显微镜成像深度极限：显微镜穿透整个小鼠大脑皮层和胼胝体，首次实现对自由运动小鼠海马CA1亚区神经元功能的直接观测记录，神经元钙信号最大成像深度可达1.2毫米，血管成像深度可达1.4毫米。此外，在光毒性方面，全皮层钙信号成像仅需要几个毫瓦的功率，海马钙信号成像仅需要20毫瓦至50毫瓦，大大低于组织损伤的安全阈值。《自然-方法》杂志还专门配发社评文章，高度评价这一成果：从微型化单光子显微镜到微型化三光子显微镜，成像深度有了数量级的提升，对脑科学具有深远影响。
研发团队与微型化多光子显微镜的结缘，源于30多年前——1992年，程和平用世界上第二台双光子显微镜，首次实现了心肌线粒体成像。“双光子显微镜和三光子显微镜原理类似，是荧光分子同时吸收两个光子发射荧光的光学成像技术。”程和平说。双光子显微镜的研发，为后续“三光子”的诞生，奠定了基础。2013年，国家自然科学基金委员会启动了国家重大科研仪器研制项目。程和平领衔申请了“超高时空分辨微型化双光子在体显微成像系统”项目并成功获批。2017年，团队成功研制了第一台微型化双光子显微镜，重约2.2克，首次获取了小鼠在自由行为过程中大脑皮层神经元和神经突触活动的动态图像。该成果获得了科技部评选的2017年度“中国科学十大进展”，同时与其他自由运动成像技术被《自然-方法》杂志评为2018年度方法——“无限制行为动物成像”。致广大而尽精微。自2013年立项至今，程和平团队历经10年，完成了从超高分辨率成像向更广、更深成像的科研布局。眼下，他们又将目光投向了广袤的宇宙苍穹——“要研究生命科学，太空是一个难得的实验室。在失重环境下，人体细胞是如何完成新陈代谢的，大脑的神经元又将发生怎样的变化，都是很好的研究课题。”自2019年起，程和平团队在中国载人航天工程办公室的支持下，组建了空间站双光子显微镜项目团队，致力于将显微镜“送上天”。2022年9月，空间站双光子显微镜研制成功；随即于当年11月12日，搭乘天舟五号货运飞船顺利抵达中国空间站，成为世界上首台进入太空的双光子显微镜。今年2月上旬的一天，神舟十五号航天员乘组使用这台空间站双光子显微镜，首次开展在轨验证实验任务并取得成功。航天员用探头轻轻掠过脸部和前臂，一旁的电子屏幕上立即显示出皮肤结构及细胞的三维分布影像。坐在中国航天员科研训练中心的程和平，目睹航天员传回的操作画面，享受着身边此起彼伏的掌声和欢呼声，心潮难平。为了达到航天应用的苛刻标准，研究团队经历了无数次失败，完成了一次次蜕变——精密的显微镜，要能承受飞船发射时的剧烈震动，就要求它足够抗震。“最初，激光器的核心部件曾被震得粉碎。”为了给显微镜“强健筋骨”，团队将激光器的核心部件设计为固态结构，以增强激光器的机械强度，同时在激光器外部增加了减震装置，相当于加了一个“保险层”；为了模拟太空极端的环境条件，他们将激光器核心部件置于-40℃至80℃的温度下循环试验，使部件在短期内反复承受极端高低温变化应力以及极端温度交替突变的影响，以排查隐患；为了确保万无一失，团队还制作了多组关键部件样品，进行加量级、破坏性的震动冲击试验，保证显微镜能满足航天发射环境下各种极端条件的挑战……最终，团队实现了多项突破：世界上首次双光子显微镜在轨正常运行，国内首次飞秒激光器在轨正常运行，国际上首次在轨、在体观测航天员细胞结构和代谢成分信息。面向未来，程和平团队正在启动下一轮的技术革新，他们希望利用微型化多光子显微镜，为脑科学量身打造颠覆性技术，直接服务生命健康。例如，观察抑郁症患者的神经系统，找到其精神变化的症结；用于人脑、消化道甚至呼吸道肿瘤的早筛早诊等。十年前，一颗在未名湖畔种下的种子，如今已生根发芽、开枝散叶。十年春华秋实，由中国科学家研发的微型化多光子显微镜，正在引领全国乃至全世界的研究者向着脑海深潜。
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